1. 引言

同種異體造血干細(xì)胞移植（allo-HCT）是免疫治療中一種有效方法，通過天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)協(xié)同產(chǎn)生抗腫瘤作用。通過識別腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）或次要組織相容性抗原（mHags），供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）給移植后白血病復(fù)發(fā)的患者可介導(dǎo)抗腫瘤作用。

然而，由于大多數(shù)TAA自身蛋白表達(dá)異常，以致T細(xì)胞表達(dá)低親和力T細(xì)胞受體（TCR），排斥反應(yīng)可能比移植物抗腫瘤效應(yīng)（GVT）更強(qiáng)。雖然用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病效果很好，而急性白血病異體淋巴細(xì)胞輸注療效有限，其2年生存率不到20%。

此外，并發(fā)癥移植物抗宿主?。℅VHD）造成病人死亡或生活質(zhì)量下降占顯著比例，有報道顯示接受匹配供體的造血干細(xì)胞移植的患者GVHD發(fā)生率高于50%。雖然有報道稱產(chǎn)生植物抗腫瘤效應(yīng)（GVT）而沒有發(fā)生移植物抗宿主?。℅VHD）的情況，本文編譯作者愛康得Paul認(rèn)為兩種機(jī)制的重疊，次要組織相容性抗原（mHags）介導(dǎo)了移植物抗腫瘤效應(yīng)（GVT）和移植物抗宿主?。℅VHD），可同時作用于造血和非造血組織。

臨床試驗中將次要組織相容性抗原（mHags）特異性T細(xì)胞擴(kuò)增并過繼輸注到移植后疾病復(fù)發(fā)的患者身上，部分患者可獲得暫時性完全緩解（CR），然而此方案因果規(guī)律復(fù)雜，并且T細(xì)胞在體外擴(kuò)增長達(dá)12周。長期的培養(yǎng)可導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，這可能是其在患者體內(nèi)持續(xù)性有限的一個潛在原因。

另一個方法是利用轉(zhuǎn)基因TCR或嵌合抗原受體（CAR）基因修飾的T細(xì)胞。然而TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞受HLA限制，TCR和內(nèi)源性TCR錯配可導(dǎo)致親和力降低或表達(dá)不期望的特異性。而CAR可作為免疫治療的通用平臺，因為它不受HLA限制。在T細(xì)胞單鏈殺傷裝置上負(fù)載特異性抗體，這種錯配的風(fēng)險很低。另外，HLA識別抗原的獨(dú)立機(jī)制，可以防止CAR-T細(xì)胞在抗原的處理加工中出現(xiàn)免疫逃避機(jī)制。

通常CAR-T只在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間非多態(tài)地識別表面分子，以提高對其安全的正當(dāng)關(guān)切。事實上，輸注CAR-T細(xì)胞使難治性白血病得到完全緩解的同時，也會伴有細(xì)胞因子釋放綜合征，在靶向腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）的實體瘤時甚至可出現(xiàn)致命的非腫瘤靶向毒性。這些問題促使美國國立衛(wèi)生研究院重組DNA咨詢委員會提供了一些臨床建議，包括實施小劑量遞增方案，共表達(dá)自殺基因來阻斷不可控毒性的或控制遠(yuǎn)期毒性。

在這篇綜述中，我們將討論基因修飾的自體或異體T細(xì)胞，用于癌癥免疫治療的安全性的當(dāng)前理念和應(yīng)對措施。（相關(guān)會議推薦：下一代CAR與免疫細(xì)胞治療研討會即將于11.7在上海舉行！）

2. CAR-T細(xì)胞的設(shè)計

鑒于第一代CARs（圖1A）有限的擴(kuò)增和持久性，研究者在病毒特異性T細(xì)胞表面導(dǎo)入CAR，為了可以讓抗原遞呈細(xì)胞交叉遞呈的抗原產(chǎn)生共刺激。11位患有進(jìn)展期神經(jīng)母細(xì)胞瘤的兒童給予disialoganglioside GD2第一代CAR修飾的EB病毒特異性CTL細(xì)胞?；蛐揎椀募?xì)胞在幾乎一半的病例體內(nèi)持續(xù)了數(shù)周的轉(zhuǎn)運(yùn)與介導(dǎo)的客觀反應(yīng)，11患者中3/4獲得完全緩解。

圖1：CAR的結(jié)構(gòu)和降低毒性的雙靶向臨床前策略。（A）CAR的胞外結(jié)構(gòu)包括先導(dǎo)序列，單鏈可變區(qū)(scFv)(H (重) 和L (輕) 鏈)，通過接頭（如SG，GS）連接。間隔區(qū)（如人免疫球蛋白D分子鉸鏈區(qū)）具有柔韌性并連接跨膜區(qū)（TM）。跨膜區(qū)包括例如人免疫球蛋白G的恒定區(qū)，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括CD3ζ內(nèi)切域（第一代的CARs），加上CD28域（第二代），或再加一個額外的共刺激域（第三代CARs）。（B）用雙靶向來減少毒性反應(yīng)：(i)反式信號傳導(dǎo)CAR將共刺激域和殺傷域分別靶向2種不同的腫瘤抗原，當(dāng)只有1個抗原結(jié)合時限制CAR的激活，(ii)抑制性CAR是用抑制性信號域取代ζ鏈，抑制了共表達(dá)活化CAR的激活信號，(iii)串聯(lián)型CAR是由單結(jié)構(gòu)靶向2個不同抗原的2個抗原結(jié)合片段組成的，當(dāng)它們同時結(jié)合可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。CAR-1和CAR-2作為示例，分別識別抗原-1和抗原-2.

為進(jìn)一步提高CAR-T的擴(kuò)增能力和持續(xù)性，研究人員在ζ鏈中加入了一種或多種共刺激信號域，這便分別出現(xiàn)了第二代和第三代CARs，主要提高CAR修飾的T細(xì)胞擴(kuò)增能力和避免T細(xì)胞誘導(dǎo)激活的細(xì)胞凋亡（圖1A）。確實，臨床前模型證明這一嘗試是成功的，后來的臨床試驗也證實了在CD19惡性淋巴瘤患者中使用的二代CD19 CAR-T細(xì)胞，其擴(kuò)增能力和持久性高于第一代CD19 CAR-T細(xì)胞。

來自許多機(jī)構(gòu)的臨床試驗報道了靶向復(fù)發(fā)性難治性急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的驚人療效?？偟膩碚f，已報道的CD19 CAR-T細(xì)胞控制并緩解了患者的復(fù)發(fā)性難治性急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。大多數(shù)試驗包括化療清髓都是努力為了給T細(xì)胞擴(kuò)增創(chuàng)造一個有利的內(nèi)環(huán)境。Davila等人報道在輸注CD28共刺激域的CAR-T細(xì)胞，50%成人白血病患者獲得了造血干細(xì)胞移植的效果，在最后一次隨訪時仍在持續(xù)緩解。Maude報告了30名兒童和成人患者接受了4-1BB共刺激域的CD19 CAR-T細(xì)胞治療，其中27例患者(90%)獲得完全緩解（CR），包含2名blinatumomab難治性和15名接受過造血干細(xì)胞移植的患者。CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)應(yīng)答擴(kuò)增可通過血液，骨髓和腦脊液檢測到。6個月的無進(jìn)展生存率為67%，總生存率為78%。研究者證實在此項試驗中，患者即使不進(jìn)行同種異體造血干細(xì)胞移植，CAR治療可能會讓患者持續(xù)緩解長達(dá)2年以上。

Lee等人，以學(xué)齡兒童和年輕人為主的復(fù)發(fā)性難治性急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL），通過CD28共刺激域的自體CD19 CAR-T治療，70%B型急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患者和60%MRD陰性的患者獲得完全緩解。12名治療后MRD陰性患者中有10名接受了異體造血干細(xì)胞移植，在中位隨訪中保持無疾病狀態(tài)10個月。

已有報道CD19 CAR治療難治性慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者的成功案例，而更大規(guī)模的CD19-CAR研究需要在非霍奇金淋巴瘤上進(jìn)行，非霍奇金淋巴瘤的CD20 CAR-T細(xì)胞治療初步獲得了一些可喜的成績。本文編譯作者愛康得Paul認(rèn)為CAR-T治療實體瘤的最佳療效可能需要一些額外的修飾。盡管晚期實體瘤患者接受抗間皮素mRNA電轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞治療(RNA-CAR-T-meso cells)出現(xiàn)腫瘤消退的證據(jù)，而神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者使用GD2靶向的CAR-T細(xì)胞治療可見疾病的完全緩解。通過他優(yōu)秀的綜述可知，CAR的靶向抗原種類在迅速增加。

提高體外擴(kuò)增的基因修飾的T細(xì)胞療效的維持，自我更新，侵潤以及歸巢能力正在積極的研究中。值得注意的是，在大部分研究中，T細(xì)胞激活用CD3/CD28小體而不是可溶的CD3-抗體，這可能有助于提高體內(nèi)的療效。

在臨床試驗中需要評估，幼稚細(xì)胞還是中央記憶細(xì)胞誘導(dǎo)的效應(yīng)T細(xì)胞，能有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力、持久性和抗腫瘤活性。意大利研究小組報道，在低濃度(IL)-7和IL-15中，用CD3和CD28抗體偶聯(lián)小體激活的幼稚T細(xì)胞能促進(jìn)T記憶干細(xì)胞（TSCM）的持續(xù)和擴(kuò)增，分別連續(xù)植入小鼠中，提示有自我跟新的能力。

3.自體CAR T-Cells輸注的副作用

在臨床試驗中CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生非腫瘤靶向作用和細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），以及在急性髓性白血?。ˋML）的臨床前模型中有明顯的骨髓抑制。

嚴(yán)重不良事件（SAEs）可能與一些因素相關(guān)，包括輸注細(xì)胞的劑量，受治者體內(nèi)的殘留病灶以及靶抗原在正常組織中的表達(dá)量。

由于腫瘤相關(guān)性抗原也會在正常組織中表達(dá)，為了盡量降低基因重組T細(xì)胞的毒性風(fēng)險，首先應(yīng)選取腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的抗原。然而這樣的抗原通常不易獲得，當(dāng)靶向目標(biāo)抗原時，進(jìn)行體外和（或）體內(nèi)試驗來嘗試預(yù)測毒性的風(fēng)險。體外細(xì)胞毒性試驗充滿挑戰(zhàn)，TAA重定向的T細(xì)胞與表達(dá)目的抗原的靶向腫瘤細(xì)胞，包括來源于正常組織的細(xì)胞，可能不會重現(xiàn)體內(nèi)模型的三維立體復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

體內(nèi)動物模型包括注射人基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，表達(dá)人抗原的人源化抗原轉(zhuǎn)基因小鼠模型，或在小鼠T細(xì)胞上導(dǎo)入CAR分子靶向鼠源相關(guān)抗原的小鼠模型。盡管已在動物模型中對細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和B細(xì)胞再生障礙進(jìn)行了研究，但存在的一些局限性可能限制這些現(xiàn)象在人類中重現(xiàn)，人和動物的生物等效性和生物分布之間的關(guān)聯(lián)存在不同，以及有不同抗原的表達(dá)，共刺激分子的表達(dá)和（或）細(xì)胞因子環(huán)境。非靈長類動物模型也被用來評價基因修飾的T細(xì)胞對正常組織的毒性，其優(yōu)點(diǎn)是它與人蛋白序列同源性程度較好。

正如之前所述，為盡力提高細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增和抗腫瘤活性，第二、三代CAR被開發(fā)出來。然而可以預(yù)料的是由于T細(xì)胞被高度活化和（或）協(xié)同刺激，輸注第二、三代CAR-T細(xì)胞會導(dǎo)致毒性風(fēng)險的增加。事實上，輸注第二代CAR-T細(xì)胞會造成較高的嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征（sCRS）發(fā)生率。在治療實體瘤中，由于肺上皮細(xì)胞表達(dá)低水平的HER-2，以及包含CD28和4-1BB共刺激分子的高效CAR，靶向HER-2抗原的第三代CAR-T細(xì)胞可引發(fā)致命的肺毒性。

CD19 CAR-T細(xì)胞研究中，B細(xì)胞再生障礙和細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）常被報道。一些患者會發(fā)生令人擔(dān)憂的但可逆的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如譫妄和癲癇發(fā)作，后者更像是全身T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而不是CAR-T細(xì)胞直接導(dǎo)致的腦毒性。CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于髓性白血病已在小鼠模型中測試，進(jìn)一步的臨床開發(fā)被嚴(yán)重的骨髓抑制所阻礙，因此必須找出克服這種嚴(yán)重不良反應(yīng)的方法，例如備用正常的造血干細(xì)胞和成熟的造血祖細(xì)胞。

另一個潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)是利用植入熱點(diǎn)的整合型載體修飾的細(xì)胞，可能導(dǎo)致致癌基因失去調(diào)控而癌變。雖然在時刻監(jiān)控著輸注的轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，但是在臨床研究中，使用轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞導(dǎo)致這種嚴(yán)重的不良反應(yīng)至今未有報道。

4. 美國國立衛(wèi)生研究院重組DNA咨詢委員會的建議

這些建議為進(jìn)行CAR-T臨床研究的科學(xué)家提供指導(dǎo)。這些建議對第一代CAR-T細(xì)胞的臨床試驗（不含EB病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞）和第二、三代CAR-T細(xì)胞的臨床試驗進(jìn)行了區(qū)分，在給藥指導(dǎo)中，對細(xì)胞因子或預(yù)處理以及輸注的劑量時間提供建議。對于第一代CAR-T細(xì)胞，第一代CAR負(fù)載的EBV T細(xì)胞，第二、三代CAR-T細(xì)胞，建議臨床初始劑量分別為3?106/kg，3?106/kg，3?105/kg。當(dāng)靶向新抗原時，則建議將上述劑量分別降至3?104/kg，1?104/kg和1?104/kg。需要注意的是這些建議劑量基于未篩選的CAR-T細(xì)胞，而最終之前的亞型篩選可能對毒性有影響。

對于細(xì)胞因子的使用，它有助于第一代CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增，對第二、三代CAR-T細(xì)胞的潛在幫助仍需進(jìn)一步的探討。而進(jìn)行化療預(yù)處理則被視為對輸注的第二、三代CAR-T細(xì)胞的存活與持續(xù)有潛在的幫助。

此外為降低輸注細(xì)胞的毒性風(fēng)險，對第二、三代CAR-T細(xì)胞輸注劑量進(jìn)行拆解是必要的，比如第一天輸注30%第二天輸注70%（在充分的安全評估后），或者通過3天分別輸注10%，30%，60%。

最后，建議使用自殺基因來阻斷未知的或不可控的遠(yuǎn)期毒性，盡管是否能控制住臨床明顯的嚴(yán)重不良反應(yīng)還未可知。

5. 細(xì)胞因子釋放綜合征的治療

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）就像炎癥反應(yīng)一樣，臨床表現(xiàn)為發(fā)燒，惡心，頭痛，心動過速，低血壓，缺氧，以及心臟或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：(i)發(fā)熱至少持續(xù)3天，(ii)兩種細(xì)胞因子濃度最高值至少升高75倍或一種細(xì)胞因子濃度最高值至少升高250倍，(iii)至少出現(xiàn)一種毒性臨床癥狀如低血壓（至少一項靜脈血管壓力），或缺氧（血氧濃度< 90%），或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（包括神志改變，遲鈍和癲癇發(fā)作）。

然而有些副反應(yīng)，比如靶向B細(xì)胞相關(guān)抗原的CAR-T細(xì)胞引起的B細(xì)胞再生障礙，可通過補(bǔ)充丙種球蛋白來輕松處置；異基因造血干細(xì)胞移植的長期護(hù)理（入選患者護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)）。細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方式，目前用類固醇進(jìn)行處置，或最近使用的IL-6單克隆抗體tocilizumab來處置。

最近提出了一項嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征的處置方案。該方案特別警告說，攜有較大殘留病灶負(fù)荷的患者接受CAR-T治療產(chǎn)生嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征的風(fēng)險更高，有可能借助IL-6在吞噬腫瘤碎片后產(chǎn)生單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞活化綜合征，MAS）。此外，只會在嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征中觀測到C反應(yīng)蛋白（CRP）≥20 mg/dL，這項被列入了診斷嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征依據(jù)，以替代用細(xì)胞因子升高水平為依據(jù)的診斷。

所提出的方案列舉了以下4項示例：（1）如果患者將發(fā)熱至少持續(xù)2天，提前給予左乙拉西坦（2）一旦CRP水平≥20 mg/dL建議轉(zhuǎn)入ICU特別護(hù)理（3）出現(xiàn)毒性臨床癥狀，該方案建議應(yīng)考慮使用tocilizumab處置（4）如果在tocilizumab第二次給藥后患者的毒性癥狀仍沒緩解，使用類固醇是必要的，如每日兩次靜脈注射10mg地塞米松。雖然這些指南仍在驗證，他們意味著是一個有效的辦法，為系統(tǒng)處置患者的細(xì)胞因子釋放綜合征提供了指導(dǎo)。然而，因為tocilizumab和糖皮質(zhì)激素可終止輸注的T細(xì)胞的抗腫瘤作用，專門去除同種異體活性T細(xì)胞（和/或緩解炎性反應(yīng)而不完全殺滅輸注的細(xì)胞）的針對性策略需要研究和（或）實施。

6. 保障安全的對策

發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)總出現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞輸注后，這就期望能有緩解和（或）消除毒性的對策。由于大部分毒性，與輸注的T細(xì)胞大量擴(kuò)增相關(guān)，且無法用藥物來停止不期望的擴(kuò)增以緩解不良反應(yīng)，引入自殺基因或開發(fā)只針對腫瘤進(jìn)行殺傷的重組T細(xì)胞，為扭轉(zhuǎn)不利局面帶來希望。

6.1自殺基因的應(yīng)用

自殺基因可以選擇性清除過繼輸注的細(xì)胞。細(xì)胞治療制品的自殺基因除了可以選擇性清除基因修飾的細(xì)胞，還會避免鄰近的細(xì)胞和（或）組織受到傷害。

根據(jù)作用原理自殺基因技術(shù)大致分為三類：代謝，二聚化結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)和治療性單克隆抗體介導(dǎo)的安全開關(guān)。表1給出了迄今為止研究最多的自殺基因的概覽。

自殺基因理想的活化劑應(yīng)具備生物惰性，有高度的生物利用度和生物分布，并且本身低毒性或不具有毒性。

任一特定情況都應(yīng)具體設(shè)計自殺基因的方案，同時應(yīng)兼顧靶細(xì)胞的性質(zhì)，自殺基因的來源，活化劑的類型，啟動的時機(jī)和目標(biāo)群體的消除動力學(xué)。

代謝型自殺基因是基于無毒性藥物在基因修飾的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的化合物。例如磷酸化的核苷類似物人單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）與甘昔洛韋（GCV）相互作用，其產(chǎn)物以三磷酸形式進(jìn)入DNA作用于DNA聚合酶，導(dǎo)致鏈終止反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞凋亡。HSV-TK / GCV也可通過CD95/CD95-L途徑，使Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

凋亡基因（如：半胱天冬酶）通過誘導(dǎo)凋亡來清除細(xì)胞。iCasp9自殺基因包含F(xiàn)KBP12-F36V結(jié)構(gòu)域，可通過柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser連接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集結(jié)構(gòu)域。FKBP12-F36V 包含一個FKBP結(jié)構(gòu)域，在第36個氨基酸殘基位點(diǎn)上苯丙氨酸替代了纈氨酸。它具有高選擇性和亞納摩爾親和力，能夠結(jié)合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。轉(zhuǎn)基因盒子也包含平末端CD19（ΔCD19）分子，后者作為選擇性標(biāo)記以保證純度≧90%。

自殺基因的安全性和有效性已經(jīng)在單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）或iCasp9自殺基因修飾供的體淋巴細(xì)胞輸注的臨床試驗中得到證實，它能消除急性和慢性抗移植物宿主病。

單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）自殺基因修飾的供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）也可產(chǎn)生移植物抗腫瘤作用，甚至在患者體內(nèi)產(chǎn)生抗HSV-TK抗體。有解釋稱可能HSV-TK的逐步消除促成了長期的移植物抗腫瘤效應(yīng)。其他間接證據(jù)顯示在一個疾病復(fù)發(fā)的病人身上發(fā)現(xiàn)了移植物抗腫瘤作用，HLA不匹配的白血病母細(xì)胞開始減少。iCasp9 修飾的供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）產(chǎn)生的移植物抗腫瘤作用還需更大規(guī)模的研究和長期隨訪。

有趣的是，在自殺基因修飾的供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）的臨床試驗中，觀測到殘余的非同種異體T細(xì)胞長期持續(xù)存在。有一種可能的原因是，憑借少量的病毒和真菌活性T細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，優(yōu)先清除的細(xì)胞在移植物抗宿主病期間積極擴(kuò)增。盡管這體現(xiàn)了供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）使用的一個優(yōu)點(diǎn)，但對于減緩嚴(yán)重不良反應(yīng)，徹底清除CAR/TCR-T細(xì)胞或造血干細(xì)胞可能是必要的。因此，確保輸注的大部分細(xì)胞（＞99%）表達(dá)自殺基因很重要，例如通過細(xì)胞分選以確?？勺畲蠡那宄?xì)胞。

表達(dá)iCasp9的CD19/CD20 CAR-T細(xì)胞在臨床前試驗中證明是可行的，共表達(dá)iCasp9基因和抗disialoganglioside GD2分子的CAR-T細(xì)胞，治療肉瘤或神經(jīng)母細(xì)胞瘤的I期臨床實驗正在進(jìn)行(Clinicaltrials.gov 識別碼分別為 NCT01822652 和NCT01953900)。如果毒性只與轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞有關(guān)，用特異性標(biāo)記可以清除，尤其是在自體細(xì)胞治療時，但前提是被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)自殺基因，那么在發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)時就可以被清除。

使CAR-T表達(dá)自殺基因的辦法很多。細(xì)胞可用CAR構(gòu)建之前自殺基因克隆的雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，以確保所有表達(dá)CAR的細(xì)胞同時表達(dá)自殺基因。另外引入特定標(biāo)記來分選和收集表達(dá)自殺基因的細(xì)胞，在使用異體CAR-T細(xì)胞治療時強(qiáng)烈推薦使用這種方法。基因改造質(zhì)膜蛋白表達(dá)的細(xì)胞，可以用特定單抗來選擇，跟蹤，去除體內(nèi)的這類細(xì)胞。比如用逆轉(zhuǎn)錄病毒將CD20導(dǎo)入T細(xì)胞，輸入T細(xì)胞后可用CD20單抗來處置，這種自殺基因策略已在臨床前模型中得到驗證。依據(jù)這個概念，其他可用的臨床前模型也被研究，Kieback等人進(jìn)行了一項有趣的試驗，在臨床前模型中，由10個氨基酸標(biāo)記的c-myc蛋白插入TCR序列，在給予特定的單抗后，這些被修飾的細(xì)胞可以被選擇，跟蹤和清除，并且這個方法可以用在CAR結(jié)構(gòu)中。此外，倫敦的研究中制備了一個簡潔的自殺基因(RQR8)，抗原表位結(jié)合CD34使CD20表達(dá)CD34的選擇性，在給予抗CD20單抗后可以對細(xì)胞進(jìn)行追蹤和清除。另一種方法是利用人表皮生長因子受體（EGFR）片段/抗-EGFR單克隆抗體，在使用特定的單克隆抗-EGFR抗體來對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行選擇，跟蹤和清除。

6.2雙靶向策略以確保安全

鑒于自殺基因的激活可清除大部分CAR-T細(xì)胞，他將有效的緩解輸注轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞引起的副作用，而激活自殺基因僅作為最后萬不得已的辦法。但是在臨床應(yīng)用中尚未有新的方法。

有一種讓人感興趣的方法來減少CAR-T細(xì)胞治療的不良反應(yīng)，就是在T細(xì)胞上修飾2種不同的CARs，每一個CAR各對應(yīng)不同的TAA表位。也就是，1號CAR負(fù)責(zé)傳遞殺傷信號，2號CAR負(fù)責(zé)傳遞共刺激信號。在這個策略中，僅當(dāng)兩個抗原同時表達(dá)時T細(xì)胞才能被活化和產(chǎn)生效應(yīng)功能。(圖1B(i))

為避免攻擊共表達(dá)TAA的正常組織，研究者制定了一個策略即同時表達(dá)一個抑制性的CAR（iCAR）。iCARs即是加入細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）或程序性死亡-1（PD-1）信號域，盡管存在ζ鏈信號域，備用靶標(biāo)可以刺激產(chǎn)生一個抑制信號，以覆蓋ζ鏈的活化信號 (圖1B(ii))。在表達(dá)"活化型"CAR識別的TAA的正常組織中，iCAR將識別其共表達(dá)的第二抗原。重要的是，在iCAR脫離后T細(xì)胞將重新獲得殺傷靶細(xì)胞的能力。Fedorov等人在臨床前模型中證實了這項策略的可行性和有效性。

另一種新的方法是"TanCAR"技術(shù) ，即靶向兩種不同的抗原但只用一個基因轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)。TanCAR是由柔性接頭分開的兩個不同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，并且兩個TAA組成的兩個結(jié)合域同時結(jié)合產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)(圖1B(iii))。重要的是，即使1種TAA與單結(jié)構(gòu)域結(jié)合也能激活T細(xì)胞并殺滅目標(biāo)。另外在臨床前模型和一項臨床試驗中，電轉(zhuǎn)導(dǎo)mRNA編碼CAR分子的T細(xì)胞（RNA-CAR-T-meso-cells）已被成功驗證。在電轉(zhuǎn)導(dǎo)一周后RNA電轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可檢測到CAR的表達(dá)和功能，多次注射 RNA-CAR-T-meso-cells介導(dǎo)了小鼠大量血管側(cè)翼間皮瘤的消退，包括植入的從患者身上分離出的間皮質(zhì)腫瘤也出現(xiàn)了消退。通過CAR的瞬時表達(dá)，這可能為限制嚴(yán)重不良反應(yīng)提供了一個更安全的方法。在給2例患者靜脈注射后作者已證實這個途徑的安全性和可行性，1例是晚期胸膜間皮質(zhì)瘤另1例是轉(zhuǎn)移性胰腺癌，2例患者各自的原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶腫瘤負(fù)荷降低，并且CA199指標(biāo)下降。實驗室抗腫瘤活性證據(jù)發(fā)現(xiàn)了 RNA-CAR-T-meso cells產(chǎn)生的新型抗腫瘤抗體，揭示了引發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的機(jī)制。作為這一策略的關(guān)注點(diǎn)，為達(dá)到抗腫瘤的最佳效果，多次輸注導(dǎo)致了因鼠源CAR產(chǎn)生的lgE免疫應(yīng)答引起的過敏反應(yīng)。然而，使用人源化的scFv結(jié)構(gòu)域可能會降低該風(fēng)險，以及縮短輸注產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)細(xì)胞的持續(xù)時間。

7. 異體CAR-T細(xì)胞

雖然同種異體造血干細(xì)胞移植是治療血液和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤復(fù)發(fā)高?；颊叩囊粋€潛在辦法，但需其他的對策來進(jìn)一步降低移植后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。實現(xiàn)這一目標(biāo)的方法之一就是在移植后預(yù)防性輸注CAR-T細(xì)胞，盡管這可能有缺乏抗原來刺激來維持輸注的CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性的顧慮。另外，根據(jù)報道在某些情況下，在同種異體造血干細(xì)胞移植后AML復(fù)發(fā)，這是因為同種異體應(yīng)激反應(yīng)以致不匹配的HLA等位基因選擇性丟失，這些患者暴露在同種異體反應(yīng)的可怕并發(fā)癥下，即移植物抗宿主病（GVHD），而卻沒有從治療中獲益。因而異體CAR-T治療可以繞過腫瘤介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制。

10例同種異體造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)的惡性淋巴瘤患者，在接受原捐獻(xiàn)者同種異體CD19特異性CAR-T治療后，有1例完全緩解（輸注T細(xì)胞后9個月仍在持續(xù)）并且沒有發(fā)生移植物抗宿主病，但有4例患者出現(xiàn)3-4級毒性。

同種異體CAR-T細(xì)胞也可能導(dǎo)致移植物抗宿主病，因而需要更嚴(yán)格的安全措施，自殺基因是理想的選擇，因為在未修飾的供體淋巴細(xì)胞輸注（DLI）的臨床試驗中，它是迄今為止唯一被證明是有效的安全措施。

由于激活自殺基因同時也會消除移植物抗腫瘤的效果，因此在絕對必要時才開啟自殺基因。

除了圖1B中總結(jié)的自殺基因修飾方法之外，還要有最大限度降低移植物抗宿主病風(fēng)險的備選方案。或者用CAR修飾的天然的非同種異體的T細(xì)胞，如 allodepleted-T細(xì)胞，病毒特異性T細(xì)胞，自然殺傷T細(xì)胞或γδT細(xì)胞。其實，由于這個原因作者研究了一個策略，在小鼠的體內(nèi)和體外成功地將CAR導(dǎo)入γδT細(xì)胞表面。

關(guān)于CAR修飾的病毒特異性T細(xì)胞（非同種異體），例如，最近的一項臨床試驗將CD19 CAR植入巨細(xì)胞病毒，腺病毒，或EB病毒抗原特異性T細(xì)胞。該試驗入組患者復(fù)發(fā)（N：6）或高風(fēng)險復(fù)發(fā)（N：2），惡性淋巴瘤接受同種異體造血干細(xì)胞移植（N：2），細(xì)胞輸注6周后評估客觀反應(yīng)，2例患者在移植后疾病復(fù)發(fā)，另外2例持續(xù)完全緩解，所有患者均沒出現(xiàn)移植物抗宿主病。令人感興趣的是可以考慮嘗試使用供者T細(xì)胞，以基因編輯的方法敲除內(nèi)源性TCR，人工制造非同種異體細(xì)胞。

8. 結(jié)論

利用自體或異體的移植物抗腫瘤效應(yīng)，體現(xiàn)了免疫療法是治療癌癥的有力方法。這是一個激動人心的時刻，基因療法和免疫療法伴著業(yè)內(nèi)外日益高漲的熱情，正在加速發(fā)展。在未來的幾年內(nèi)將看到，是否免疫治療能踐行自身的承諾，取代或增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的藥物抗癌療法，并具備長期的抗癌監(jiān)視，包括在可以逃逸的部位，即使作為輔助治療也是如此。要獲益需要先克服風(fēng)險，必須進(jìn)行嚴(yán)格的臨床試驗，制定策略來減弱或消除毒性。