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AAV病毒包裝

日期：2016-10-21 10:34:21

(一) AAV-293細(xì)胞的凍存
隨著傳代的次數(shù)增加，AAV-293 細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類(lèi)現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開(kāi)始就對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大量?jī)龃妫员ＷC實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。
1、去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基;
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。
3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 預(yù)熱的 10% DMEM，用 10mL 移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細(xì)胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即為 10 倍稀釋?zhuān)靹?，?10ul 細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4 大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以 4(得每大格細(xì)胞數(shù))，再乘以 10(10 倍稀釋)，即為實(shí)際 n 萬(wàn)/mL 細(xì)胞濃度。
4、細(xì)胞離心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。
5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液(70%完全培養(yǎng)基 20%FBS 10%DMSO)重懸細(xì)胞，密度為3 x 106 個(gè)/ml。
6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長(zhǎng)久保存，并作記錄。保存過(guò)程中，要不時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞存活率，觀察細(xì)胞狀態(tài)等。
(二)AAV-293 細(xì)胞的傳代
當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合率達(dá)到 80%~90%時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。
2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。
3、根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml 培養(yǎng)基。
(三)AAV-293 細(xì)胞的復(fù)蘇
當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，或者細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。
1、設(shè)置溫度為37~42℃的水浴。
2、查看細(xì)胞庫(kù)記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞(需戴上棉手套，防止被凍傷)，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，盡量在1~2min 內(nèi)使細(xì)胞溶液完全
溶解。
3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000 rpm/min，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6 cm 培養(yǎng)皿。
5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37℃、5% CO2 和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
(四)AAV包裝和濃縮
1. 質(zhì)粒擴(kuò)增
構(gòu)建好的AAV載體、包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒需經(jīng)過(guò)大量抽提，濃度大于1ug/ul，A260/280 在1.7-1.8 間方可用以包毒。推薦使用Qiagen 大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提。
2. 傳AAV-293細(xì)胞
將培養(yǎng)AAV-293 細(xì)胞T75 瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37 度培養(yǎng)箱中3-5min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中預(yù)熱的10% DMEM，移液槍用10mL 移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對(duì)準(zhǔn)培口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細(xì)胞。之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL 離心管中，取50ul 混勻后的細(xì)胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10% DMEM，即為10 倍稀釋?zhuān)靹颍?0ul 細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4 大格，每大格16 小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4 大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以4(得每大格細(xì)胞數(shù))，再乘以10(10 倍稀釋)，即為實(shí)際n 萬(wàn)/mL 細(xì)胞濃度。傳代當(dāng)天記為第一天，若第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，鋪900-1000 萬(wàn)/T75;若第三天轉(zhuǎn)染，鋪350-400 萬(wàn)/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度，80-90%滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前無(wú)需換培養(yǎng)基。
3. 做脂轉(zhuǎn)complex

試劑名稱(chēng)	試劑數(shù)量
載體質(zhì)粒	5ul(1.0ug/ul)
包裝質(zhì)粒	5ul(1.0ug/ul)
輔助質(zhì)粒	5ul(1.0ug/ul)

注：LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說(shuō)明參考LipofiterTM說(shuō)明書(shū)。
4. AAV 病毒收毒：
病毒顆粒同時(shí)存在于包裝細(xì)胞和培養(yǎng)上清中?？梢詫⒓?xì)胞和培養(yǎng)上清都收集下來(lái)以獲得最好的收率。
1) 準(zhǔn)備一個(gè)干冰乙醇浴(將乙醇傾入裝有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37?C 水浴;
2) 將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一同收集到一個(gè)15ml 的離心管中。收集細(xì)胞時(shí)，將培養(yǎng)盤(pán)傾斜一定角度將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中;
3) 1000 rpm/min，離心3 分鐘，分離細(xì)胞和上清，將上清另外存放，細(xì)胞用1ml PBS 重懸;
4) 將細(xì)胞懸浮液在干冰乙醇浴和37?C 水浴中反復(fù)轉(zhuǎn)移，凍融四次。每次融解后稍加震蕩。注意：每次凝固和解凍大概需要十分鐘的時(shí)間。
5. AAV 病毒濃縮：
1) 10,000 g 離心去除細(xì)胞碎片，將離心上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中。
2) 將兩次收集的上清混合在一起，用 0.45um 濾器過(guò)濾除雜質(zhì)
3) 加入 1/2 體積的 1M NaCl，10% PEG8000 溶液，混合均勻，4度過(guò)夜
4) 12,000 rpm 離心 2h，棄上清，病毒沉淀用適量的 PBS 溶液溶解，待完全溶解后用 0.22um 濾器過(guò)濾除菌。
5) 加入 Benzonase 核酸酶消化去除殘留的質(zhì)粒DNA(終濃度為50 U/ml)。合上管蓋，顛倒幾次以充分混合。在37 ?C 孵育30 分鐘;
6) 用 0.45 μm 過(guò)濾頭過(guò)濾，取濾出液，即為濃縮的AAV病毒。
6. AAV的純化
1) 向病毒濃縮液中添加固體 CsCl 直到密度為1.41 g/ml(折射率為1.372);
2) 將樣品加入到超速離心管中，用預(yù)先配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液將離心管剩余空間填滿;
3) 在 175,000 g 下離心24 小時(shí)，以形成密度梯度。按順序分步收集不同密度的樣品，取樣進(jìn)行滴度測(cè)定。收集富集有AAV 顆粒的組分;
4) 重復(fù)上述過(guò)程一次。
5)將病毒裝入100 kDa的透析袋，4度透析脫鹽過(guò)夜。此即為純化的AAV病毒
AAV病毒包裝滴度測(cè)定(采用 Q-PCR 法)
1)取 20ul 濃縮病毒液，加入 1ul RNAse-free DNAse，混勻，37℃水浴反應(yīng)30min。
2)4℃，12 000 rpm/min，離心 10 min，取 10ul 上清到另一個(gè)無(wú)菌的 1.5ml EP 管中。
3)加入 90ul Dilution Buffer(1 mM Tris-HCl, pH 8.0，0.1 mM EDTA，150 mM NaCl)，混勻，37℃金屬浴反應(yīng) 30min。
4)自然冷卻至室溫，加入 1ul 蛋白酶 K，65℃水浴反應(yīng) 1h。
5)100℃金屬浴反應(yīng) 10min，自然冷卻至室溫。
6)進(jìn)行 Q-PCR 檢測(cè)滴度。
AAV病毒的儲(chǔ)存、稀釋
1. 病毒的儲(chǔ)存：
收到病毒液后在很短時(shí)間內(nèi)即使用腺相關(guān)病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫時(shí)放置于 4℃保存;如需長(zhǎng)期保存請(qǐng)放置于-80℃(病毒置于凍存管，并使用封口膜封口)。
1)病毒可以存放于-80℃ 6 個(gè)月以上;但如果病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò) 6個(gè)月，建議在使用前需要重新測(cè)定病毒滴度。
2)反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度：每次凍融會(huì)降低病毒滴度10%;因此在病毒使用過(guò)程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融，建議收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。
2. 病毒的稀釋?zhuān)?/span>
如果需要稀釋病毒，請(qǐng)將病毒取出置于冰浴融解后，使用 PBS 緩沖液或培養(yǎng)目的細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)?；靹蚍?裝后 4℃保存(請(qǐng)盡量在三天內(nèi)用完) 分裝后使用。
AAV使用安全注意事項(xiàng)
1.病毒操作時(shí)最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒，請(qǐng)不要打開(kāi)排風(fēng)機(jī)。
2.病毒操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，帶口罩和手套。
3.操作病毒時(shí)特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時(shí)超凈工作臺(tái)有病毒污染，請(qǐng)立即用 70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干凈。接觸過(guò)病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液等請(qǐng)用 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡過(guò)夜后棄去。
4.用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時(shí)應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用 70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開(kāi)顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺(tái)之前，用70%乙醇清理顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺(tái)。
5.如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。
6.脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。

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